（找不到封面配图了，请大家赏花_(:з」∠)_。新鲜的，周末才拍出来的。）
1992～2002年间发表在Science和Nature上的一系列研究向人们揭示了CaMKII蛋白在学习和记忆中起到的作用。下面将回顾其中的几篇文章。
在1992年之前，研究者们就猜想，LTP可能是一种学习机制。当时支持这种猜想的证据只有一条，即阻断NMDA受体会导致空间学习能力受损。但是这条证据是有问题的，因为阻断NMDA受体会导致突触功能缺陷，从而干扰海马回路的功能。为了解决这个问题，Sliva等人想要在保持突触功能正常的情况下减少对突触激活水平，从而检验是否能消除LTP。而αCaMKII是一个被发现只存在于神经系统中的蛋白激酶，且它一旦自我磷酸化后就不再依赖于Ca+/CaM；一些学习模型中也发现了这种机制。也就是说，αCaMKII可能与LTP有关。
提一句，1992年7月的Science杂志被Sliva的组霸刊了，连发了两篇文章。一篇讲基因变异模型及细胞水平上进行的模型检验，一篇专门讲行为学水平上的模型检验。鉴于后者比较容易理解， 这里主要聚焦于第一篇文章。
老师说，现在想要发Science，可没那么容易了，醒醒吧别睡了。
1）αCaMKII变异模型
研究者采用基因打靶（gene target）技术在αCaMKII基因序列上的调节域中敲入一个抗新霉素的 neo 基因。这样一来，αCaMKII基因就无法正常表达出蛋白质了。
打靶载体通过电转移法 (electroporation) 被导入囊胚的胚胎干细胞。由于打靶载体带有抗新霉素的 neo 基因，整合了打靶载体的胚胎干细胞能够在有新霉素（neomycin）的环境中生长，继而被筛选出来。之后，这些干细胞打回囊胚中。
为了检验是否完全干扰了αCaMKII基因、阻断了其转译和表达，研究者先后做了南方检验（Southern analysis/blot）、西方检验（Western analysis）和北方检验（Northern analysis）。南方检验是对DNA的检验。
南方检验是对DNA的检验。上图是对野生型、变异杂合子和变异纯合子的DNA检验。Kb表示的是碱基对的多少。从图中可以看到，野生型只有单一碱基对长度的链；变异杂合子有一条和野生型一样长的链，还有两条短链；变异纯合子只有两条短链。这是因为变异链上新打入的neo基因带有限制性内切酶Pvu II的一个剪切位点，所以Pvu II可以在变异链的中间多咔嚓一刀，把一条长链变成两条短链。颜色的深浅与检验样本的质量大小有关。
北方检验是对RNA进行分析。既然已经没有原表达基因了，DNA自然无法转译，为什么还要进行RNA分析？研究者是为了确认没有DNA残链被转译成了RNA（有可能残链转译的RNA也会被表达成功能性蛋白）。在当时（1992年），人们还不知道在原表达基因已经被破坏了的情况下，是不会有RNA被转译出来的。检验的结果表明，变异的样本中没有αCaMKII或其残缺版的mRNA，但是β-CaMKII的mRNA水平与正常小鼠的无异。
最后，西方检验是对蛋白质的检验。图中最右一栏的是对照蛋白样本。从图中可以看到，变异纯合子无αCaMKII，但有β-CaMKII。（注：beta-CaMKII有两种亚型，因此图中共有三个指示箭头；kD为蛋白质质量单位。）
至此，我们可以下结论说，αCaMKII的基因变异模型被建立起来了。接下来要对其进行功能性检验。
2）解剖学及基本行为表现检验
如果对野生型和变异型小鼠的海马区所在的前脑组织进行切片染色，你有什么预期？两者的海马区会有差别吗？有什么样的差别？
行为学上呢？外观、体重会有差别吗？基本的嗅闻行为（sniffing）、求偶行为（mating）和运动机能上会有差别吗？
当然啦，你大可以做出两者相差巨大的预期，毕竟发生了基因变异，其他基因的表达是否会受到影响谁也说不好。但是偏向着"成功模型"的预期是，两者在解剖学和基本的行为表现上不应该存在显著差异。不然要如何解释后面学习差异的原因呢？
幸运的是，确实没有多大的差别。变异小鼠（纯合子）的新皮层和海马皮层的细胞排列很正常，它们也会跑会跳会交配，没有运动失调症状（ataxia）。有显著性差别的地方仅在于两处，其中一处是变异小鼠似乎更神经质一些，对于人类抚摸更加回避。
另一处则是它们在用于衡量空间记忆能力的莫里斯水迷宫（Morris Maze）等实验任务中表现出明显的缺陷 。
3）突触功能检验：全细胞记录
为什么要进行突触功能的检验呢？之前说了嘛，就是因为以前的模型阻断了NMDA受体，会影响到突触功能，说不定对海马回路都产生了影响，所以无法说究竟什么才影响了记忆（当然了，NMDA也影响记忆，但还不是核心机制）。
这样一来，成功的预期也很明了了：变异的小鼠其突触功能应当完好。
结果当然是如你所料啦（毕竟文章也发出来了_(:з」∠)_）：与野生小鼠相比，变异小鼠的突触后电位形状和峰值、阻断NMDA或非NMDA受体通道后的突触后电位峰值、电压依赖性曲线都没啥区别。也就是说，NMDA受体功能性在两者身上无差。
有区别的地方也是对模型有利的。在野生小鼠的脑片中（in vitro），如果给予一次刺激后紧接着发放第二次刺激，那么第二次刺激所诱发的突触后兴奋电位应当升高。这个现象称Paired-pulse facilitaion（成对刺激促进作用）。变异小鼠的脑切片也体现出了这种促进作用，但是明显不及野生型小鼠。也不奇怪，毕竟促进前膜突触囊泡释放的synapsin I分子，是由CaMKII调控的。
4）长时程增强作用（long-termpotentiation，LTP）受损
终于到了激动人心的时刻。
我们的预期也很简单了，变异小鼠的LTP大概是受损严重，甚至根本就消失了。毕竟它们在海马功能检验的一系列行为学测试中的表现令人失望（又令人满意）。
首先进行的是场电位记录（field potential recording），其记录的是许多神经元的活动，衡量的是突触强度（Synaptic strenghth）。突触强度，指的是给予强直性刺激后，突触后兴奋电位随时间的变化，用其与基线电位水平的百分比值表示。强直性刺激条件是100hz的20次刺激，每次刺激间隔11秒，共进行3个刺激串。结果如下图。
以给予刺激的时间点为时间轴零点。零点前记录的为基线水平。给予刺激后，场电位峰值无明显差异，但在接下来一个小时内的电位水平存在明显差异：野生型小鼠出现了长时程增强作用，而变异小鼠则很快回到基线水平。这很好理解，因为CaMKII不参与短时程增强作用（与突触前膜所释放的神经递质多少有关）。
接下来研究者对单个细胞进行了全细胞记录（whole cell recording）。结果和场电位记录是相似的。野生型小鼠在接受强直刺激后出现LTP，而变异小鼠则没有LTP。有意思的是，有两只变异纯合小鼠出现了LTP，但幅度明显不如野生型。

结论：αCaMKII变异小鼠具有明显的LTP缺陷。
二、αCaMKII蛋白上T286位点的自我磷酸化对LTP和学习记忆是否必要？（Giese et al., 1998）
时间已经行进到1998年了。对，就是《相约九八》的那个九八年。小时候听歌，总以为是《相约酒吧》，想不明白为什么1998年就要去酒吧，感觉很不"正经"。
言归正传。
还记得我们一直说的吗，αCaMKII蛋白一旦自我磷酸化之后就不再依赖于Ca++或者CaM的水平。那么自我磷酸化是否是必要的呢？这篇文章要验证的就是这一点。虽然一作换了人，但是通讯作者还是Silva。文章还是发在Science上。
研究模型的建立：
将286位点上的苏氨酸（T286）替换为丙氨酸（T286A），这样一来，该位点就不能转换到不依赖于CaM水平的状态了。也就是说它无法自我磷酸化了。接下来用Cre-LoxP系统进行DNA重组置换，将修改后的序列用质粒载体插入原基因序列中，再用新霉素进行筛选，最后用Cre重组酶剪掉LoxP位点及neo基因，得到目标基因序列。
上述模型通过了PCR和Western blot检测，解剖形态学分析也表明，野生型小鼠与变异小鼠的海马区脑组织切片无异。
场电位记录结果，与野生型相比，失去自我磷酸化能力的T286A小鼠没有LTP，但其突触传递能力没有受损。
单个神经元的全细胞记录也出现了相似的结果。
行为学测验用的仍然是莫里斯水迷宫。图中的空心圆圈表示的是野生型的测试结果，而实心方块表示的是变异小鼠的测试结果。可以看到，经过10次左右的测试后，野生小鼠很快就能找到水中的隐藏平台，而变异小鼠需要花费更多的时间（A），并且一旦撤掉可见平台上的旗子，野生小鼠就很难找到平台（D-E）。
结论：αCaMKII蛋白上T286位点的自我磷酸化对LTP和学习记忆来说是必要的。
三、加强αCaMKII的自我磷酸化能够使小鼠变聪明吗？（Mayford et al., 1996）
仍然是Science上的文章。该文发表于1996年。一作又换了人，但是仔细一看，通讯作者是诺奖得主Eric R. Kandel，那本神经科学圣经Principles of Neural Science的编者之一。
在这项研究中，他们采用了与前两篇文章不一样的基因编辑手段，转基因技术。
相比于基因打靶技术，转基因技术不要求进行基因序列定位，只要把载体打进去就好了。这样一来，又省钱省力，但缺点就在于，你不知道转基因究竟转入了原始基因序列中的什么位置。它有可能会干扰正常的基因表达，也可能不会。因此，如果要使用转基因技术进行研究，需要用多个不同的品系，得到一致性结果才能验证你想要验证的结论。
研究者使用了强力霉素（Doxycycline）来调控转基因的表达。如图，他们生产了两种类型小鼠。第一种类型的小鼠能在αCaMKII启动子的调控下表达tTA，而另一个类型的小鼠会在tet-O启动子的调控下表达CaMKII-Asp286。 Asp286是286位点的另一种变异，与上文中无法自我磷酸化的T286A相反，它能使CaMKII上的酶一直处于不依赖于Ca++的状态，也就是一直都在自我磷酸化。
而这两种转基因小鼠交配产生的子代小鼠，部分会同时带有两种基因。这会产生什么样的效果呢？当tTA结合在tet-O启动子上的时候，CaMKII-Asp286就能够表达，但如果给予强力霉素（Doxycycline，DOX），那么DOX就会与tTA结合，并脱离tet-O启动子，从而关闭CaMKII-Asp286的表达。
这么做是要干嘛？上一篇文章不是说阻断自我磷酸化小鼠就变笨了不会学习了么。好嘛，那我就让它一直一直磷酸化，是不是就会变聪明啦？这idea真的很棒棒哦。让我们来看看场电位记录和行为学测试的结果。
超乎想象的是，一直自我磷酸化并不会产生更强的LTP，反而失去了LTP。并且在空间记忆实验的Barnes水迷宫中，实验老鼠也表现得很差劲（B13和B22表示的是用于转基因的不同品系）。也就是说，过度的自我磷酸化并不能让小鼠变
结论：过度的自我磷酸化并不能增强记忆能力。
四、对记忆力增强的不懈追求 （Tang et al., 1999）
1998~1999年，Nature发了两篇文章，都是关于记忆力增强的实验。1998年的那篇文章（Migaud et al., 1998）表明，通过PSD-95来增强LTP并不能提升记忆力表现。99年的这篇文章则表明，NMDA受体亚型NR2B的国度表达，有利于提高NMDA受体的活性，并促进了突触增强作用。
他们的做法并不复杂，使用的也是转基因技术，让NR2B过表达。

NR2B受体通道的开放时间要长一些。
场电位记录表明，NR2B过表达的变异小鼠不仅拥有增强的LTP，而且也保留了LTD。
也许正是因此，它们在行为学的测试中才表现得更聪明，恐惧条件发射建立和消退得都更快。
结论：NR2B受体在前脑的过表达能够提高NMDA受体活性，提高突触促进作用，并使个体在学习和级以上的表现更好。
五、结语
时至今日，学习与记忆的研究仍然属于热点问题。我国的脑科学研究重点就在于学习、记忆与教育。为什么学习与记忆这么重要？站在普通年轻人的角度上看，提高记忆力好像无非就是记东西更好一些罢了，貌似也没有什么很大的提升。而且说实话，又能提升多少呢。但是对于某些人群来说，比如智力障碍（intellectual disorder）患者或是老年人，这一点点改变所带来的影响是巨大的，对生活质量的提升也是很明显的。
另外，在接下来的专栏文章中，我们也会提到，记忆与情绪的关联作用。从某种意义上来说，很多情况下，记忆无意识地影响了我们的知觉、情绪、思维、执行能力等各个方面。它好像是你最不可或缺的工具书，最常用的代码模块，最长陪伴于身边的物件，比如一副耳机，一块手表，一支钢笔，而你每天都在无数次地使用它。它与你紧密关联，说它就是你的影子也不为过。
参考文献：
Silva, A. J., Paylor, R., Wehner, J. M., & Tonegawa, S. (2009). Impaired Spatial Learning in L-Calcium-Calmodulin Kinase Mutant Mice, 257, 6.
Silva, A. J., Stevens, C. F., Tonegawa, S., & Wang, Y. (2009). Deficient Hippocampal Long-Term Potentiation in o-Ca cium- Calmodulin Kinase Mutant Mice, 257, 6.
Giese, K. P. (1998). Autophosphorylation at Thr286 of the Calcium-Calmodulin Kinase II in LTP and Learning. Science, 279(5352), 870–873. https://doi.org/10.1126/science.279.5352.870
Migaud, M., Charlesworth, P., Dempster, M., Webster, L. C., Watabe, A. M., Makhinson, M., … Grant, S. G. N. (1998). Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature, 396(6710), 433–439. https://doi.org/10.1038/24790
Tang, Y.-P., Shimizu, E., Dube, G. R., Rampon, C., Kerchner, G. A., Zhuo, M., … Tsien, J. Z. (1999). Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature, 401(6748), 63–69. https://doi.org/10.1038/43432
来源：知乎 www.zhihu.com
作者：知乎用户（登录查看详情）
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